论文导读：现代生物技术在海洋天然产物开发和海洋药物研究中的应用主要体现在海洋天然活性产物的筛选以及利用生物技术生产海洋药物两个方面，此外，其在海洋生物的培养以及海洋天然产物的分离纯化等过程中也得到了广泛的应用。广义的海洋药物基因工程是指利用源自海洋的药物基因重组生产药用蛋白（或多肽）或以海洋生物作为“生物反应器”生产药用蛋白（或多肽），因此，可按照供体基因的来源以及表达体系的不同，将其分为2个研究方向：其一是海洋药物基因的重组表达、其二是海洋生物反应器。

　　关键词：现代生物技术，海洋药物

　　现代生物技术作为融合现代生命科学与多学科理论研究手段的高新技术，在世界范围内为新型药物的研究与发展开辟了广阔的前景。各种生物技术在药物研究领域的交互应用倍受瞩目，如模型筛选和药靶发现，基因组和蛋白质组研究、生物信息和药物设计，新型给药系统与纳米技术等，以发现和确证新型药物为主要目标，在生命科学前沿取得了快速的发展[1]。

　　现代生物技术在海洋天然产物开发和海洋药物研究中的应用主要体现在海洋天然活性产物的筛选以及利用生物技术生产海洋药物两个方面，此外，其在海洋生物的培养以及海洋天然产物的分离纯化等过程中也得到了广泛的应用。

　　1 海洋药物的分离纯化

　　在已发现的1000余种有活性的海洋天然产物中，绝大多数属于大环内酯类、萜类、生物碱类以及聚酯类等成分，可通过植物化学手段，依据这些成分的极性不同，利用不同的溶剂系统加以分离，此外，CO2超临界萃取技术以及各种层析技术也开始广泛应用于这些小分子的分离纯化过程。

　　在海洋生物体内存在着一些肽类和蛋白质，具有很高的抗肿瘤、抗菌、抗病毒以及抗凝血等活性，如： 张成武等[2]研究发现，螺旋藻藻蓝蛋白在80mg·L – 1浓度时对人血癌细胞株HL60有极显著的抑制作用，在20mg·L - 1浓度时对K562 和U2937 细胞均有显著抑制作用；另有报道从鳖鱼肝脏中分离到的一种肝刺激物质 （sHSS）可以明显抑制乙肝病毒模型鸭血清中HBV的DNA水平[3]，并可以显著抑制CCl4致肝损伤模型小鼠血清中ALT和AST活性，具有明显的保肝护肝功能[4] 。

　　在肽类和蛋白质的分离纯化过程中，一般根据目的蛋白的分子量和极性等性质，采用凝胶过滤层析、离子交换层析以及制备电泳等方法加以分离纯化。由于大多数具有生物活性的多肽是在生物机体的特定发育阶段表达的，因此，在样品的采集过程中，需要考虑目的蛋白的富集问题，取特定发育阶段的样品可以提高目的产物的回收率；此外由于这些活性多肽在生物机体内是以微量形式存在的，需根据目的产物的热、酸碱稳定性以及分子量大小，通过热提、调节提取液的pH以及超滤等过程去除大多数杂蛋白以提高分离纯化的效率。

　　关于分离纯化蛋白的理化性质的研究，一般可采用等电聚焦电泳、变性和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱、氨基酸组成及序列分析以及圆二色谱等方法，对蛋白质的等电点、分子量、分子组成及一级结构等进行全面的分析；对一些新

　　型未知功能的蛋白质和多肽，还可以通过核磁共振、x-衍射及计算机辅助分析的方法，对它们进行高级结构的预测，以探讨可能的构效关系。

　　2 海洋药物的大规模筛选系统

　　通过筛选而获得具有生物活性的先导化合物，是海洋药物研究的关键，目前药物筛选模型已经从传统的整体动物、器官和组织水平发展到细胞和分子水平。天然产物的筛选途径主要有三种：一种是建立在对生物组织成分分析基础上的“组成引导型”；第二种是利用传统的植化分析手段对生物机体内的一些具有特定极性的成分进行分离研究，并通过一些特殊的设备对分离到的成分进行结构分析的“化学结构引导型”；第三种是以活性检测为引导的天然活性成分研究，即“活性引导型”，此方法的特点是利用一些药物筛选模型，对分离出的天然成分进行筛选，从中筛选具有特定生物活性的产物，因其目标极为明确，容易从大量的天然产物中“锁定”目标产物[1]。前两种方法则因为分离出的组分大多不具备生物活性而导致大量无效的工作。

　　近年来，随着细胞培养技术、转基因动物实验技术以及生物芯片技术的发展，建立在分子和细胞水平上的高通量筛选（ High Throughoutscreening， HTS）技术已日趋成熟，因该方法具有样品用量少、工作效率高、筛选费用低廉以及可较好地反映药物作用的机制等特点，欧美一些发达国家已将这种筛选力一法作为常规的新药筛选途径，我国在此方面的工作起步较晚，到目前为止，我国建立在分子和细胞水平的新药筛选模型仅有400余种。

　　2.1 基因芯片技术

　　基因芯片又称DNA芯片或DNA微阵列，属于生物芯片的一种。生物芯片是根据生物分子间特异相互作用的原理，将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对多肽、蛋白质及其他生物成分的高通量快速检测[5]。

　　Scherf[6]等用含10000个基因的微阵列对60个肿瘤细胞系的基因表达谱进行分析，结果发现大部分细胞系保留了其原代分离组织的特征基因表达，又进一步评价122种药物对这些细胞系基因表达的影响，从中筛选出抗肿瘤药物候选化合物，并对其作临床药效评价。通过基因技术分析不同药物的疗效差异，可以识别患者个体的差异，尤其是对疾病的易感性的差异和对于药物反应的差异的识别是个性化医学的基础。

　　基因芯片可用来比较中药用药前后组织（细胞）中基因表达的变化，所发现的一组基因很可能是药物作用的靶点，可作为进一步药物筛选或验证的靶点。据报道，香港科技大学生物技术研究所利用基因芯片已筛选到知母的23种有效成分，如果再从cDNA表达文库中得到的肽库制作肽芯片，则可以从众多的药物成分中筛选到起作用的部分物质。它能使新药筛选高度并行、高通量、微型化、自动化，大大提高新药研制速度[7]。

　　2.2 基因敲除以及基因导入技术

　　基因敲除和基因导人技术是20世纪80年代后期利用基因重组技术发展起来的一门新技术，其技术基础是胚胎干细胞（ES细胞）的分离和体外培养技术，目前已广泛应用于动物病理模型和新药筛选模型的建立中。其机制是通过对一些重大疾病相关基因的认识，对一些模式动物（如小鼠等）的染色体进行操作，在其染色体中删除（deletion）或导入（ transformation）这些基因，使动物发生性状上的改变（表现为相关疾病的症状），此模型因更接近于临床疾病的表型，因而更适合于新药的筛选工作，具有筛选准确率高的特点。

　　3 海洋药物基因的克隆技术

　　一般来说，具有很高生物活性的物质在海洋生物体内是以微量的形式存在的，远远不能满足临床前药学研究的需要的。为获得足够的中试样品，一般可以通过细胞培养来发酵生产目的产物，由于目前有关海洋生物的细胞培养技术还不够完善，且实验室的条件与海洋生物生活的环境具有很大的差异，因此，为使培养的细胞能大量产生目的产物，还需要不断的摸索海洋生物细胞的培养方法和发酵条件；另一种可行的途径是通过现代基因工程技术获得大量表达的重组产物。

　　克隆新基因的方法有多种，在已知蛋白序列（如蛋白质的N－端序列）的情况下，一般可以根据其N－端氨基酸序列设计简并引物，利用RT-PCR和RACE-PCR方法从组织中获得该蛋白相对应的核苷酸序列。另一种克隆新基因的方法是根据已知其它陆生生物基因的保守序列设计引物，利用RT-PCR技术从生物组织的总RNA提取物中克隆目的基因，此方法在克隆亲缘关系较近物种的同源基因方面往往很容易获得成功，但是，由于陆生生物和海洋生物的亲缘关系很远，两者体内的蛋白基因在同源性方面可能不高，因此，在同源基因的克隆方面需要慎重。

　　最有效的新基因克隆方法是对生物特定组织的cDNA文库进行筛选。因此，插人的cDNA片段可表达产生融合蛋白，具有定的抗原性和生物活性，将分离到的天然蛋白通过杂交瘤技术获得单克隆抗体后，可通过抗原－抗体反应的方法从cDNA文库中筛选到目的基因；也可以用天然产物免疫小鼠或兔，获得通过减法杂交（Subtractivehybridization）或差异显示技术（DifferentialDisplay RT-PCR）获得生物体特定发育时期表达的基因或基因片段（需要通过文库筛选的方法获得。通过对它们的重组表达产物的活性研究，也可能获得具有药用开发潜力的药用蛋白或多肽。

　　最新研究进展有：将DNA微阵列技术在海绵细胞培养上进行了应用，构建了斑节对虾遗传连锁图谱，建立了海洋红藻EST，从海星卵母细胞中分离出成熟蛋白酶体的催化亚基，初步表明硬骨头鱼类IGF2I原E2肽具有抗肿瘤作用[8]； Ahsan等克隆了鳗鱼胰蛋白酶原基因；Richardson等克隆了东方的干扰素调节因子基因并分析了其基因组结构；Mitsuo等克隆了一种新的鳗鱼细胞色素P450cDNA；Maccatro等克隆了真鲷肌肉生长抑制因子基因[9]。

　　4 海洋药物基因工程

　　广义的海洋药物基因工程是指利用源自海洋的药物基因重组生产药用蛋白（或多肽）或以海洋生物作为“生物反应器”生产药用蛋白（或多肽），因此，可按照供体基因的来源以及表达体系的不同，将其分为2个研究方向：其一是海洋药物基因的重组表达、其二是海洋生物反应器。

　　4.1 海洋药物基因的重组表达

　　利用现代生物技术，如基因工程、发酵工程以及细胞工程等技术，使得获得海洋活性多肽或蛋白不再依靠大量采集海洋生物。

　　近几年来的主要进展包括：McKenna等 [9]将IPNV病毒的A片段基因重组到Semliki森林病毒表达载体PSFV1上，获得了重组的IPNV蛋白； 秦松[2]等在克隆到别藻蓝蛋白（APC）基因后，利用DNA重组技术将该基因与大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白（MBP）基因构建成嵌合基因，转化大肠杆菌后获得高效表达MBP-APC融合蛋白的基因工程菌株，该重组产物具有明显的抑制小鼠S180肉瘤的活性。

　　4.2 海洋生物反应器

　　海洋药物与其他生物药物一样都经历了三个发展阶段：（1）采集和加工野生资源；（2）人工栽培和养殖药源；（3）把药物基因转入易转化、生长快和表达率高的生物种类中表达。随着生命科学进入基因时代，第三个阶段的发展在加快。生物反应器（ Bioreactor）一般是指利用固定化酶及固定化细胞高效生产产物的技术。

　　虽然海洋中任何一种生物都有可能作为表达外源药物基因的生物反应器，但实际上只有人们最了解的种类才便于进行这种分子克隆的操作至今在海洋生物中用得较多的是微藻，已有蓝藻红藻、绿藻和硅藻转化成功，其中，蓝藻分子生物学的研究近几年来一直处于整个生物学的前沿[10]。1994年我国和日本学者同年报道了在蓝藻中表达药物基因成功。十多年来中国科学院植物研究所与合作者们已在蓝藻中成功地表达了6个药物基因：人肿瘤坏死因子a、人表皮生长因子、人尿激酶原、人小肠三叶因子、人粒细胞集落刺激因子、人和小鼠的金属硫蛋白；同时，还对载体的启动子、终止子、SD序列等调控因子作了研究，使外源基因表达效率从国际上平均为可溶性蛋白的千分之几，提高到3.3%～5%[11]。

　　从现有资料来看，海洋天然产物在化学结构上既具有较大程度的新颖性，又具有较为复杂的多样性（不亚于陆生中药成分）。这不仅表明在物质基础方面海洋药物与陆生中草药有一定的共性，而且结构新、活性强、毒性低的海洋天然产物可直接作为开发新药的先导化合物。虽如此，海洋药物药源问题仍历史性地被带人21世纪。只有开辟新的资源领域，探索新的方法和技术，实现技术上的跨越，才有可能解决制约海洋药物产业化的瓶颈因素。就技术来说，生物系统筛选技术、海洋化学生态学、海洋生物基因组学、蛋白质组学、生物组合化学等学科、方法和技术的发展正是未来海洋药物研究开发实现技术跨越的基石。

　　纵观国内外海洋生物活性物质研究的成功范例，可以看出：资源学研究是基础；政府宏观指导与参与、企业积极介入，以及广大海洋学、医药学科研工作者精诚合作，使科研项目取得较大力度的支持，从而推动研究工作向纵深发展。

　　参考文献

　　[1] 郝方，张雪莲，张顺宝等。 生物技术在新药研发中的进展与展望。 宁夏医学杂志， 2005，27（2）：142-143

　　[2] 张成武，刘宇峰，王习霞等。 螺旋藻藻蓝蛋白对人血癌细胞株HL260 ，K2562和U2937 的生长影响[J ] . 海洋科学，2000，24 （1） :45.

　　[3] 吴梧桐，郭显，王友同。 防治肝病的鳖鱼肝刺激物质及其制备方法。 中国发明专利，发明专利证书：JL99114463.5，国家专利主分类号：COCK14-435

　　[4] 郭昱，吴梧桐。 鳖肝肽对小鼠免疫性肝损伤的保护作用及免疫调节作用。 中国药学杂志。 2001.1: 44-46

　　[5] 龚宁波，张丽娟，古同男。 基因芯片技术在医药学研究中的应用。 中南药学，2005，3（1）：35-37

　　[6] Scherf U，Ross DT，Waltham M，et al. A gene expression dadabase for the molecular pharmacology of cancer[J].Nat Genet，2000，24（3）：236

　　[7] 武瑞，连学昭。 基因芯片技术在中药研究中的应用。 中兽医医药杂志，2005.（1）：21-23

　　[8]The Abstract of 5th International MarineBiotechnology Conference （IMBC2000），29 September-4 October，2000， Townsville， Australia.

　　[9]Chen T T. Marine Biotechnology[M]. New York: SpringerPress，2001.

　　[10] 施定基。 藻类基因工程制备重组药物。 第七届海洋湖沼药物学术开发研讨会。中国药学会海洋药物专业委员会编辑出版，大连，2001，212271

　　[11] 施定基，赵兴贵，邓元告等。 展望分子海洋药物学。 中国天然药物，2005，3（3）：133-137